Solução de problemas de Electroforese em Gel

eletroforese em gel de poliacrilamida , ou PAGE , é uma técnica vulgarmente utilizada para a separação de moléculas orgânicas , em uma amostra biológica . As moléculas com menor tamanho e peso mais rapidamente migrar num gel de poliacrilamida , quando uma corrente eléctrica é aplicada . Claras bandas distintas são geralmente observadas após o gel de concluída é incubada numa mancha particular. É um método relativamente simples . No entanto , a ausência de bandas ou bandas que manchem ou são impuras poderia indicar um problema em uma ou mais etapas do método . Você deve seguir as diretrizes básicas para solucionar problemas de um método de eletroforese em gel quando os resultados não são os esperados. Coisas que você precisa de Quality bis grau : acrilamida ou placas pré-moldadas
duas placas de vidro
acrilamida : bis
TBE tampão (Tris , ácido bórico, EDTA)
Alimentação
superior câmara tampão
câmara baixa tampão
Proteína de amostra de DNA
Temed
persulfato de amônio
Gel mancha
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Comece com o passo final de eletroforese em gel de primeira e funciona para trás . Para electroforese em gel , o passo final é o procedimento de coloração utilizado para observar bandas da amostra . Alguns problemas devem realmente ocorrer durante o processo de coloração . No entanto , as manchas em pó deve ser bem dissolvido no tampão apropriado antes de serem utilizadas para corar um gel . Determinar a concentração correta da mancha foi usado.
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Verifique a fonte de alimentação. A ausência de bandas poderia indicar a configuração atual ou a tensão estava muito alta e as amostras de teste migraram fora do gel. Alto configurações também podem causar componentes da amostra para migrar através do gel muito rapidamente, causando a baixa resolução e bandas que aparecem impuro . As amostras não podem migrar através do gel se a definição da fonte de alimentação é baixa. As amostras também pode derivar do poço onde eles foram carregados e não migram através do gel.
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Verifique a acrilamida líquido usado para lançar o gel de poliacrilamida. Tipicamente , a percentagem de acrilamida usado para lançar um gel de poliacrilamida a intervalos de 5 a 15 por cento . As amostras compostas de moléculas de maiores dimensões são carregados num gel de 5 por cento , porque grandes fragmentos se movem mais lentamente em géis de acrilamida com uma percentagem mais elevada . Pequenas moléculas são carregados em um por cento gel maior porque uma baixa concentração de gel não seria capaz de resolver amostras menores .
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Confira os reagentes utilizados para polimerizar a acrilamida. Um gel de poliacrilamida é formada por polimerização de uma mistura líquida que consiste em acrilamida e acrilamida . Persulfato de amónio e TEMED são adicionados com a acrilamida para catalisar a formação do gel . Tipicamente , a acrilamida deve mostrar sinais de polimerização ( formação do gel ) 15 minutos após ter sido adicionado persulfato de amónio e TEMED . A polimerização que ocorre muito rapidamente é o resultado de grandes quantidades de persulfato de amónio . Muito pouco persulfato de amónio pode causar polimerização incompleta ou irregular .
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confirmar a quantidade das amostras carregadas . Altas concentrações de amostras pode mover lentamente através do gel e reduzir a resolução da banda . A concentração da amostra que é baixo não pode ser observada depois de o gel foi corado . Essas manchas têm limitações quanto à quantidade mínima de amostra que pode ser trabalhada como resultado de sensibilidade mancha.
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Confirmar qualidade das amostras carregadas. Os sais e outros contaminantes presentes numa amostra podem afectar o movimento da amostra ao longo do gel . A electroforese é o resultado de uma corrente eléctrica que atravessa um gel que contém um tampão corrente de realização ; As concentrações elevadas de sal na amostra podem afectar o movimento de essa corrente através do gel . Seu isolamento de uma amostra deve incorporar um kit de purificação que irá produzir uma amostra relativamente puro.
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literatura Deixe seu comentário ou o protocolo escrito para determinar se a página apropriada foi utilizado para realizar o experimento. A percentagem de acrilamida em PAGE é específico para o tamanho da amostra a ser testada . A literatura também pode fornecer informações específicas no que diz respeito a criação de da fonte de alimentação e taxa de migração da amostra.