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Como fazer um mapa de restrição

Nos primeiros dias da biologia molecular , os cientistas comumente utilizado mapeamento de restrição para compreender os genes que estavam estudando . Em modernos laboratórios de pesquisa , mapeamento de restrição é largamente ultrapassada porque seqüenciamento tornou-se mais amplamente disponível e mais econômico do que no passado. No entanto , existem casos em que um mapa de restrição pode ser adequado para um investigador para executar suas investigações . A abordagem geral para mapeamento de restrição envolve o uso de enzimas digestivas para quebrar fisicamente uma amostra de ADN . Depois de medir os produtos desta digestão , você pode " remontar " as peças e deduzir a seqüência original de DNA. Coisas que você precisa
Restrição enzimas
Amostra DNA
Solução tampão
Gelo e banho de água quente
Gel equipamento de eletroforese
Show Mais instruções
DNA Digestão

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Adicione uma enzima de restrição à sua amostra de DNA. Use EcoR1 , uma enzima comumente usado , por exemplo.
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Adicione esta mistura para uma solução tampão , que é essencialmente um lugar para que a reação ocorra .
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Elevar a temperatura da reacção , tal como indicado no manual de New England Biolabs . Cada enzima de restrição tem uma temperatura de reacção específico no qual funciona melhor . Além disso, cada enzima tem uma seqüência de nucleotídeos específica que se destina a atingir. EcoRI irá digitalizar e cortar o DNA no CAATTC sequência de nucleotídeos . Esta ordem exacta de nucleótidos deve existir para que a enzima ligar-se e cortar o ADN . Até este ponto , todos os materiais devem ser mantidos em gelo para evitar a actividade indesejada .
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Após permitir que a reacção ocorra , tal como indicado no manual , executar -se a mistura em uma máquina de electroforese em gel para separar o ADN fragmentos com base no tamanho . Os menores fragmentos vai passar o mais distante em todo o gel.
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Meça a distância percorrida por cada fragmento de DNA. Estas cinco etapas devem ser repetidas com várias enzimas diferentes separadamente.
Construindo o mapa de restrição
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Usando os dados obtidos a partir do gel , recolher todas as informações que você encontrou utilizando as enzimas de restrição diferentes .
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deduzir a ordem dos locais de restrição por meio da comparação dos diferentes comprimentos de fragmentos produzidos por cada uma das enzimas . Por exemplo, se a enzima N º 1 produziu dois fragmentos de igual comprimento e enzima º 2 produziu três fragmentos de igual comprimento , você pode concluir que a enzima N º 1 cortes no meio do DNA e enzima º 2 corta o DNA em terços .

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Usando as conclusões tiradas no passo 2, montar a ordem de sítios de restrição para o DNA.